powerUp™SYBR™Green MasterMix 简要操作说明（Rev.A.O）
2026-08-27 15:30
PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix 简要操作说明（Rev. A.0）
货号： A25741 ，A25742 ，A25743 ，A25776 ，A25777 ，A25778 ，A25779 ，A25780 ，A25918
本操作说明提供了 PowerUp SYBR Master Mix 的简要操作指南。更详细信息，请至赛默飞世尔官方网站下载英文版说明书：
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0013511_PowerUp_mastermix_UG.pdf
货号 | 包装规格 | 反应次数（20 µl 体系） | 保存条件 |
A25741 | 1 mL | 100 | 2-8 度 |
A25742 | 5 mL | 500 | |
A25743 | 50 mL | 5000 | |
A25776 | 2 × 5 mL | 1000 | |
A25777 | 5 × 5 mL | 2500 | |
A25778 | 10 × 5 mL | 5000 | |
A25779 | 2 × 1 mL | 200 | |
A25780 | 5 × 1 mL | 500 | |
A25918 | 10 × 1 mL | 1000 |
一 ．总体实验要求
● 在使用本试剂之前，请将其充分涡旋混匀。
● 每个样本推荐进行四次重复
● 建议设置无模板对照（NTC）。NTC 中包括除模板以外的所有 qPCR 反应成分（包含 PowerupUp SYBR Greeen Master Mix，引物，ddH2O) 。 NTC 理论上应该没有扩增。
● 如果要减小反应体系，请将各组分按比例缩减。不推荐小于 10 µl 的反应体系。
二 ．配制反应体系
1. 按照下表配制 PCR 反应体系（注：配制多个反应孔时，请为各组分预留 10%的余量，以免移液损失。）
组成成分 | 10 µl 体系 | 20 µl 体系 |
2 X PowerUp SYBR Green Master Mix | 5 µl | 10 µl |
正向引物和反向引物[ 1] | — | — |
cDNA 模板和 ddH2O[2] | — | — |
总体积 | 10 µl | 20 µl |
[ 1]建议正 、反向引物的终浓度各为300-800 nM
[2]建议每个反应孔使用 1-10 ng cDNA 或 10-100 ng gDNA 2. 反应体系配好后，盖上反应盖，充分涡旋混匀，离心。
3. 将反应液分装到每个反应孔中。封上贴膜，离心，避免产生气泡。
三 ．运行 qPCR 反应程序
1. 将反应板放在荧光定量 PCR 仪上，根据需要选择快速或标准 PCR 反应程序，并按照以下表格设置反应参数。（注：如果反应模板是 gDNA，推荐使用标准反应程序。在 7900HT 仪器上，推荐使用标准反应程序。）
Table 1 快速反应程序（引物 Tm≥60 °C）
阶段 | 温度 | 时间 | 循环 |
UDG 酶激活 | 50°C | 2 分钟 | Hold |
预变性 | 95°C | 2 分钟 | Hold |
变性 | 95°C | 1 秒[ 1] 或 3 秒[2] | 40 |
退火/延伸 | 60°C | 30 秒 |
[ 1]使用 QuantStudio 系列或 ViiA7 qPCR 仪
[2]使用 7500 Fast ，StepOnePlus 或 StepOne qPCR 仪
Table 2 标准反应模式（引物Tm≥60 °C）
阶段 | 温度 | 时间 | 循环 |
UDG 酶激活 | 50°C | 2 分钟 | Hold |
预变性 | 95°C | 2 分钟 | Hold |
变性 | 95°C | 15 秒 | 40 |
退火/延伸 | 60°C | 1 分钟 |
Table 3 标准反应模式（引物 Tm<60°C）
阶段 | 温度 | 时间 | 循环 |
UDG 酶激活 | 50°C | 2 分钟 | Hold |
预变性 | 95°C | 2 分钟 | Hold |
变性 | 95°C | 15 秒 | 40 |
退火 | 55-60°C[ 1] | 15 秒 | |
延伸 | 72°C | 1 分钟 |
[ 1]退火温度根据引物的 Tm 值进行设置
四 ．设置熔解曲线
1. qPCR 反应结束后，如果将反应板避光保存，则在反应结束后 72 小时内仍可进行熔解曲线的分析。如果不能将反应板避光保存，则需在反应结束后的 24 小时内进行熔解曲线的分析。
Table 4 熔解曲线条件
阶段 | 升降温速度 | 温度 | 时间 |
1 | 1.6°C/秒 | 95°C | 15 秒 |
2 | 1.6°C/秒 | 60°C | 1 分钟 |
3[ 1] | 0.15°C/秒 | 95°C | 15 秒 |
[1]荧光采集步骤
2. 在 ABI 品牌荧光定量 PCR 仪上按照如下设置：反应类型：标准曲线
试剂：SYBR Green 试剂
报告基团：SYBR
淬灭基团：None
参比荧光染料：ROX
运行模式：标准模式或快速模式
熔解曲线模式：Continuous（连续的）
3. 设置反应体积，开始运行实验。
五 ．实验数据分析
1. 观察扩增曲线
2. 设置合适的基线和阈值
3. 观察熔解曲线，检查反应体系中是否存在非特异性扩增或引物二聚体。
4. 进行相对定量或绝对定量的计算
